Los biosensores (dispositivos que utilizan moléculas biológicas para detectar la presencia de una sustancia objetivo) tienen un gran potencial para biomarcadores de enfermedades, acciones moleculares en diversos procesos biológicos o para detectar toxinas y otras sustancias nocivas en el medio ambiente. Uno de los tipos más comunes, los biosensores fluorescentes, consisten en una biomolécula de unión a un objetivo unida a una molécula sonda que emite luz fluorescente. Sin embargo, los biosensores fluorescentes son generalmente reactivos de bajo contraste porque sus sondas fluorescentes están siempre “encendidas” y las moléculas del biosensor no unidas deben eliminarse antes de que se pueda detectar una señal precisa.
Un importante paso adelante son los “biosensores fluorescentes activados por unión” (nanosensores) de alto contraste que se iluminan sólo cuando se unen a sus moléculas objetivo, pero fabricar tales nanosensores es un desafío ya que se necesita una unión efectiva al objetivo y un interruptor de fluorescencia. ser combinados en un pequeño paquete molecular que puede entregarse de manera eficiente a una amplia variedad de muestras y ampliarse de manera rentable.
Ahora, un equipo de investigación colaborativo del Instituto Wiss de la Universidad de Harvard, la Facultad de Medicina de Harvard (HMS), el MIT y la Universidad de Edimburgo (Reino Unido) ha desarrollado una plataforma de biología sintética para agilizar el descubrimiento, la evolución molecular y la fabricación rentable. Nanosensores pequeños y altamente eficientes que pueden detectar proteínas, péptidos y moléculas pequeñas específicas aumentando su fluorescencia hasta 100 veces en menos de un segundo. Como componente central, la plataforma utiliza nuevos aminoácidos fluorogénicos (FgAA) que pueden codificarse en pequeñas secuencias de proteínas (aglutinantes) de unión al objetivo con un enfoque innovador que permite in vitro La difusión del código genético. A través de un proceso de detección, validación y evolución dirigida de sensores de alto rendimiento, la plataforma permite una conversión rápida y rentable de aglutinantes de proteínas en nanosensores de alto contraste para investigación básica, monitoreo ambiental, diagnóstico médico y una amplia gama de aplicaciones. Terapéutica mejorada. Se publican los resultados comunicación de la naturaleza.
“Hemos trabajado durante mucho tiempo para expandir el código genético de las células para darles nuevas capacidades que permitan la investigación, la biotecnología y la medicina en una variedad de campos, y esta investigación es una extensión muy prometedora de este esfuerzo. in vitro“, dijo George Church, Ph.D., miembro principal de la facultad de Wyss, quien dirigió la investigación. “Esta novedosa plataforma de biología sintética aborda muchos de los obstáculos que se interponen en el camino de la mejora de las proteínas con nueva química, como lo ejemplifican los biosensores instantáneos más capaces. , y está preparado para impactar muchas áreas biomédicas “. Church es líder de la Plataforma de Biología Sintética en el Instituto Wyss y también Profesor Robert Winthrop de Genética en HMS y Profesor de Ciencias y Tecnología de la Salud en la Universidad de Harvard y el MIT.
Proteína más andamio equivale a nanosensor
El equipo está dirigido por el coautor y coautor correspondiente Erkin Kuru, Ph.D. El grupo de Church se basó en el descubrimiento anterior de que los FgAA pueden convertir aglutinantes de proteínas conocidas en sensores ópticos cuya fluorescencia se activa cuando su FgAA se intercala entre su secuencia aglutinante y la molécula objetivo. Los investigadores de Wyss colaboraron con el coautor Mark Vendrell, PhD, profesor de la Universidad de Edimburgo y experto en química traslacional e imágenes biomédicas con quien Kuru compartió un interés temprano en los FgAA.
A partir de la pandemia, el equipo imaginó por primera vez un “diagnóstico instantáneo de COVID-19” y se centró en un pequeño anticuerpo diseñado (nanocuerpo) que se une a la proteína de pico del SARS-CoV-2 en la superficie del virus. Desarrollaron cientos de variantes de aglutinantes para ensamblar FgAA, esencialmente unidos químicamente a aminoácidos de cisteína o lisina que se introdujeron genéticamente en uno de los 20 andamios químicos fluorogénicos diferentes en posiciones conocidas en estrecho contacto con el objetivo de la púa. Utilizando un ensayo de unión simple, seleccionaron variantes fluorogénicas que producían el mayor aumento de fluorescencia en milisegundos tras la unión al objetivo.
Luego utilizaron el mismo proceso para crear nanosensores a partir de nanocuerpos o miniproteínas que se unen a varios sitios objetivo del SARS-CoV-2, así como a una variedad de otros objetivos moleculares, incluido el receptor EGFR del factor de crecimiento celular relevante para el cáncer. Los biólogos celulares utilizan los péptidos con etiqueta ALFA para rastrear proteínas y la hormona del estrés cortisol dentro de las células. Es importante destacar que los nanosensores demuestran su utilidad como herramientas eficaces de obtención de imágenes para detectar la presencia de sus objetivos en células humanas y bacterias vivas bajo el microscopio.
Evolución de los nanosensores
A pesar de su potencial, la primera versión de la plataforma estaba limitada al depender de un proceso que requería mucho tiempo y mano de obra y que implicaba múltiples pasos de purificación de las secuencias de aglutinantes producidas. “Queríamos ampliar aún más nuestro espacio de diseño molecular aumentando las capacidades de alto rendimiento de la plataforma”, afirma Kuru. “Para lograr esto, permitimos que el ribosoma, que sintetiza naturalmente todas las proteínas en la célula, hiciera la mayor parte del trabajo en un proceso diseñado sin células”.
En la versión 2.0 de su plataforma, el equipo desarrolló el llamado “aminoácido sintético” al que ya se le ha adherido un andamio fluorogénico. Los aminoácidos sintéticos ya han demostrado su valor en medicina, como el medicamento para bajar de peso Ozempic; Sin embargo, no se pueden incorporar fácilmente a secuencias de proteínas porque no existe una maquinaria natural para manipularlos por parte del ribosoma. “Para superar este obstáculo, reasignamos un codón poco utilizado en el código genético universal con una nueva química de expansión genética, de modo que pudiera codificar aminoácidos sintéticos similares a nuestros FgAA prefabricados no estándar. Básicamente, rediseñamos la unión – proceso de síntesis de proteínas activadas para la construcción de nanosensores fluorescentes”, dijo el coautor principal Jonathan Ritchier, PhD, quien codesarrolló el método.
Su nuevo proceso no sólo permitió a los investigadores producir millones de candidatos a nanosensores a la vez, sino que también ayudó a acelerar las pruebas posteriores de los nanosensores, ya que toda la mezcla de síntesis podría combinarse directamente con moléculas objetivo o agregarse a células vivas sin ningún aditivo. Purificación Ahora pueden investigar cientos de variantes en un día en lugar de decenas a lo largo de varias semanas. Destacando el poder de la plataforma desarrollada, descubrieron una ubicación específica para codificar sus FgAA en el aglutinante de nanocuerpos original del SARS-CoV-2 que, inesperadamente, produjo un nanosensor de mayor afinidad que su nanosensor COVID-19 original después de interactuar con el objetivo del pico. proteína.
Finalmente, como esto aumentaría significativamente el potencial para crear nanosensores superiores, el equipo utilizó su plataforma para optimizar la secuencia de nanocuerpos. Aprovecharon un proceso clásico de biología sintética conocido como “evolución dirigida” en el que las proteínas se optimizan mediante ciclos iterativos de diseño, construcción y prueba utilizando las versiones de la proteína con el mayor potencial identificadas dentro de un ciclo como base para encontrar otras mejores. El siguiente. Comenzando con el mejor nanosensor que habían diseñado previamente para detectar la proteína de pico de la cepa original del SARS-CoV-2, Kuru, Rittichier y el equipo crearon una extensa biblioteca de nanocuerpos que incluía variantes que mantenían el FgAA no estándar en la posición original, pero tenía otros importantes Muchos aminoácidos estándar se reemplazan por otros estructuralmente diferentes en la posición. Optimizarlos conduce a nuevos nanosensores con una afinidad de unión mucho mayor a las proteínas de pico. Curiosamente, utilizando una versión modificada de este método de evolución dirigida, descubrieron nanosensores que podían detectar selectivamente nuevas y distintas formas de ómicrones.
“Este es un importante paso adelante en nuestra capacidad para diseñar rápidamente biosensores fluorescentes de bajo costo para el seguimiento de enfermedades en tiempo real y con un gran potencial para el diagnóstico y la medicina de precisión”. “También podemos incorporar aminoácidos sintéticos con muchas otras funcionalidades en todo tipo de proteínas para crear una gama aún más amplia de nuevas terapias y herramientas de investigación”, añadió Kuru. De hecho, Kuru y la coautora Helena de Puig, Ph.D. y Alison Flores, Church y autor principal y miembro principal del cuerpo docente de Wyss, James Collins, Ph.D. Junto con esto, Wyss también inició el proyecto AminoX del instituto, que facilita la plataforma para el desarrollo de nuevas terapias.
“Este trabajo altamente innovador demuestra el tremendo potencial de la biología sintética al permitir una generación nueva y más poderosa de biosensores activados por unión. El equipo de Wyss ha logrado diseñar un proceso biológico fundamental en una plataforma que, en última instancia, tiene un gran potencial para resolver muchos diagnósticos y problemas terapéuticos”, dijo el director fundador de Wyss, Donald Ingber, MD, PhD, quien también Judah Folkman es profesor de biología vascular HMS y el Hospital Infantil de Boston, y Hansjörg Weiss, profesor de ingeniería de inspiración biológica En mares
Los autores adicionales del estudio son Shuvrajit Rout, Isaac Hahn, Abigail Rees, Thomas Bartlett, Fabio de Moliner, Sylvie Bernier, Jason Galpin, George Marchand, William Bedell, Lindsey Robinson-McCarthy, Christopher Ahron, Thomas Bernhard y David Rudner. El estudio fue apoyado por un proyecto de validación del Instituto Wyss, una subvención del Departamento de Energía de EE. UU. (Premio n.° DE-FG02-02ER63445) y una subvención de consolidación del ERC (Premio n.° DYNAFLUORS, 771443), así como una beca de la Life Science Research Foundation para Kuru.