Cada planta, animal y persona es un microcosmos rico en células diminutas y especializadas. Estas células son mundos en sí mismas, cada una con sus propias partes y procesos únicos que escapan al ojo humano. Ser capaz de ver el funcionamiento interno de estos bloques de construcción microscópicos con una resolución nanométrica sin dañar sus delicados orgánulos ha sido un desafío, pero científicos de todas las disciplinas del Laboratorio Nacional Brookhaven del Departamento de Energía de EE. UU. (DOE) han encontrado una manera efectiva de observar células individuales utilizando múltiples técnicas. Se reveló el fascinante proceso de captura de estas imágenes Biología de la comunicación.
Ser capaz de comprender las estructuras internas de las células, cómo interactúan las sustancias químicas y las proteínas dentro de ellas y cómo estas interacciones señalan procesos biológicos específicos con una resolución nanométrica podría tener implicaciones importantes en la medicina, la agricultura y muchos otros campos importantes. Este trabajo está allanando el camino para mejores técnicas de imágenes biológicas y nuevos instrumentos para optimizar las imágenes biológicas.
“Estudiar las células humanas y los orgánulos dentro de ellas es apasionante”, afirmó Kun Liu, biólogo estructural del laboratorio de Brookhaven, “pero hay muchas oportunidades de beneficiarse de nuestro enfoque multimodal que combina la tomografía computarizada de rayos X duros y la fluorescencia de rayos X. Mediante el estudio de hongos o bacterias beneficiosas podemos ver no sólo la estructura de estos microorganismos sino también los procesos químicos cuando las células interactúan de diferentes maneras”.
Los componentes básicos de la vida son un solo tirón.
Antes de que los investigadores pudieran siquiera comenzar a obtener imágenes, uno de sus mayores desafíos fue preparar la muestra en sí. El equipo decidió utilizar una línea celular de la línea 293 del riñón embrionario humano (HEK). Se sabe que estas células son fáciles de cultivar pero difíciles de medir con múltiples rayos X. Aunque son muy pequeñas, las células son bastante sensibles al daño inducido por los rayos X.
Los científicos pasaron por un proceso cuidadoso de varios pasos para fortalecer la muestra. Usaron paraformaldehído para preservar químicamente la estructura celular, luego un robot sumergió rápidamente las muestras en etano líquido, las transfirió a nitrógeno líquido y finalmente las secó para eliminar el agua pero mantener la estructura celular. Una vez que se completa este proceso, los investigadores colocan las células liofilizadas bajo un microscopio y las etiquetan para obtener imágenes específicas.
Con sólo 12-15 micrones de diámetro (el cabello humano promedio tiene 150 micrones de espesor), configurar la muestra para la medición no fue fácil, especialmente para mediciones en diferentes líneas de luz. El equipo necesitaba garantizar que la estructura celular pudiera sobrevivir a múltiples mediciones con rayos X de alta energía sin daños significativos, y que la célula pudiera mantenerse en su lugar de manera confiable para múltiples mediciones. Para superar estos obstáculos, los científicos han desarrollado soportes de muestras estandarizados para su uso en múltiples órganos y han aplicado microscopios ópticos para localizar y obtener imágenes rápidamente de la célula y minimizar la exposición prolongada a los rayos X que pueden dañarla.
Medición multimodal
El equipo utilizó dos técnicas de imágenes disponibles en la Fuente Nacional de Luz de Sincrotrón II (NSLS-II), una instalación para usuarios de la Oficina de Ciencias del DOE en Brookhaven: tomografía computarizada de rayos X (XCT) y microscopía de fluorescencia de rayos X (XRF).
Los investigadores recopilaron datos XCT utilizando rayos X para informar a los científicos sobre la estructura física de las células en la línea de luz de imágenes de rayos X de campo completo (FXI). La tomografía utiliza rayos X para mostrar secciones transversales de una muestra sólida. Un ejemplo familiar de esto es la tomografía computarizada, que los médicos utilizan para obtener imágenes de una sección transversal de cualquier parte del cuerpo.
Los investigadores recopilaron datos de microscopía XRF, que proporcionan más pistas sobre la distribución de elementos químicos dentro de las células, en la línea de luz de espectroscopía de rayos X (SRX) de resolución submicrónica. En esta técnica, los investigadores dirigen rayos X de alta energía a una muestra, excitando el material y provocando que emita fluorescencia de rayos X. La emisión de rayos X tiene su propia firma única, lo que permite a los científicos saber exactamente de qué elementos está compuesta la muestra y cómo se distribuyen para realizar sus funciones biológicas.
“Estamos motivados para combinar imágenes XCT y XRF basadas en la información única y complementaria que cada una proporciona”, dijo Xianhui Xiao, científico principal de FXI Beamline. “La fluorescencia nos brinda mucha información útil sobre los oligoelementos dentro de las células y cómo se distribuyen. Esta es una información muy importante para los biólogos. Obtener un mapa de fluorescencia de alta resolución de muchas células puede llevar mucho tiempo. Incluso para una imagen 2D , puede tardar varias horas.”
Aquí es donde resulta útil obtener una imagen 3D de la habitación mediante XCT. Esta información puede ayudar a guiar las mediciones de fluorescencia en lugares de interés específicos. Esto ahorra tiempo a los científicos, aumenta el rendimiento y garantiza que no sea necesario exponer la muestra a rayos X durante largos períodos de tiempo, lo que reduce el daño potencial a las células frágiles.
“Este enfoque correlacionado proporciona información útil y complementaria que puede promover una serie de aplicaciones prácticas”, comentó Yang Yang, científico de líneas de luz en SRX. “Para algo como la administración de medicamentos, se pueden identificar subconjuntos específicos de orgánulos y luego se pueden identificar componentes específicos a medida que se redistribuyen durante el tratamiento, lo que brinda una imagen más clara de cómo funcionan estos medicamentos a nivel celular”.
Aunque estos avances en imágenes han proporcionado una mejor visión del mundo celular, todavía quedan desafíos por superar y formas de mejorar las imágenes. Como parte del proyecto NSLS-II Experimental Equipment III (planea construir nuevas líneas de luz para brindar nuevas capacidades a la comunidad de usuarios), Yang liderará el equipo científico que trabaja en la próxima línea de luz de Tomografía Celular Cuantitativa (QCT), que estará dedicada a la bioimagen. QCT es una línea de luz de tomografía de rayos X suaves de campo completo para obtener imágenes de células congeladas con resolución a nanoescala sin necesidad de fijación química. Esta línea de luz de tomografía de rayos X crio-suave complementará los métodos actuales y proporcionará más detalles sobre la estructura y funciones celulares.
Resultados futuros
Ser capaz de observar las células que forman los sistemas del cuerpo humano es fascinante, pero poder comprender los patógenos que atacan y alteran esos sistemas podría dar a los científicos una ventaja en la lucha contra las enfermedades infecciosas.
“Esta tecnología nos permite estudiar la interacción entre un patógeno y su huésped”, explica Liu. “Podemos observar el patógeno y una célula sana antes de la infección y luego obtener imágenes de ellos durante y después de la infección. Observaremos cambios estructurales tanto en el patógeno como en el huésped y comprenderemos mejor el proceso. También podemos estudiar las bacterias beneficiosas en el microbioma humano o interacciones entre hongos que tienen una relación simbiótica con plantas”.
Liu está trabajando actualmente con otros científicos universitarios y de laboratorio nacionales para el Programa de Investigación Biológica y Ambiental del DOE para estudiar las interacciones moleculares entre el sorgo y Colletotrichum sublinola, Hongo patógeno que causa antracnosis, que puede dañar las hojas de las plantas. El sorgo es un importante cultivo bioenergético del DOE y el quinto cultivo de cereales más importante del mundo, por lo que la humanidad tiene mucho que ganar si comprende las estrategias de este hongo destructivo y cómo funcionan las defensas del sorgo a nivel celular y molecular.
Ser capaz de ver a esta escala puede dar a los científicos una idea de la guerra que libran los patógenos en los cultivos, el medio ambiente e incluso el cuerpo humano. Esta información puede ayudar a desarrollar las herramientas adecuadas para combatir a estos atacantes o reparar sistemas que no funcionan de manera óptima en un nivel fundamental. El primer paso es poder ver un mundo más allá del alcance del ojo humano, y los avances en la ciencia sincrotrón han demostrado ser una herramienta poderosa para descubrirlo.
Este trabajo fue apoyado por el Fondo de Investigación y Desarrollo Dirigido por Laboratorios de Brookhaven y la Oficina de Ciencias del DOE.