Una forma clásica de obtener imágenes de estructuras a nanoescala en las células es con microscopios de súper resolución, costosos y de alta potencia. Como alternativa, los investigadores del MIT desarrollaron una forma de estirar el tejido antes de obtener imágenes, una técnica que les permite lograr una resolución a nanoescala con un microscopio óptico convencional.
En una nueva versión de esta técnica, los investigadores han hecho posible estirar el tejido 20 veces en un solo paso. Este método simple y económico podría allanar el camino para que casi cualquier laboratorio de biología realice imágenes a nanoescala.
“Esto democratiza la obtención de imágenes”, afirmó Laura Kiessling, profesora de Química de Novartis en el MIT y miembro del Instituto Broad del MIT y Harvard y del Instituto Koch para la Investigación Integrativa del Cáncer del MIT. “Sin este método, si quieres ver cosas en alta resolución, tienes que usar un microscopio muy costoso. Lo que esta nueva técnica te permite hacer son cosas que normalmente no puedes ver con un microscopio estándar. El costo de las imágenes Es porque necesitas una instalación especial para poder ver cosas a nanoescala”.
Con la resolución lograda por esta técnica, que es de unos 20 nanómetros, los científicos pueden ver orgánulos dentro de las células, así como grupos de proteínas.
“La expansión de 20 veces te lleva al ámbito del funcionamiento dentro de las moléculas biológicas. Los componentes básicos de la vida son las cosas a nanoescala: biomoléculas, genes y productos genéticos”, dice Edward Boyden, profesor Yeva Tan de Neurotecnología en el MIT, “Ingeniería biológica”. , Artes y Ciencias de los Medios y Profesor de Ciencias Cognitivas y del Cerebro; Investigador del Instituto Médico Howard Hughes; y es miembro del Instituto McGovern para la Investigación del Cerebro del MIT y del Instituto Koch para la Investigación Integrativa del Cáncer.
Boyden y Kiessling son autores principales del nuevo estudio, que parece El método de la naturaleza. Los estudiantes graduados del MIT Shiwei Wang y Tae Wan Shin Ph.D. ’23 son los autores principales del artículo.
Una sola expansión
El laboratorio de Boyden inventó la microscopía de expansión en 2015. Esta técnica requiere incrustar el tejido en un polímero absorbente y descomponer las proteínas que normalmente mantienen unido el tejido. Cuando se agrega agua, el gel se hincha y separa las moléculas orgánicas entre sí.
La versión original de esta técnica, que estiraba el tejido unas cuatro veces, permitió a los investigadores obtener imágenes con una resolución de unos 70 nanómetros. En 2017, el laboratorio de Boyden modificó el proceso para incluir un segundo paso de amplificación, logrando una amplificación total de 20 veces. Esto permite una resolución más alta, pero el proceso es más complicado.
“Hemos desarrollado varias tecnologías de amplificación de 20 veces en el pasado, pero requieren múltiples pasos de amplificación”, dijo Boyden. “Si se puede ampliar esa cantidad en un solo paso, se pueden simplificar bastante las cosas”.
Con un aumento de 20 veces, los investigadores pueden alcanzar una resolución de unos 20 nanómetros utilizando un microscopio óptico convencional. Esto les permite ver estructuras celulares como microtúbulos y mitocondrias, así como grupos de proteínas.
En el nuevo estudio, los investigadores se propusieron expandirlo 20 veces con un solo paso. Esto significó que tuvieron que encontrar un gel que fuera muy absorbente y mecánicamente estable, para que no se desmoronara al estirarlo 20 veces.
Para lograrlo, utilizaron un gel ensamblado a partir de N,N-dimetilacrilamida (DMAA) y acrilato de sodio. A diferencia de los geles de expansión anteriores que dependen de la adición de otras moléculas para formar enlaces cruzados entre hebras de polímero, este gel forma enlaces cruzados espontáneamente y exhibe fuertes propiedades mecánicas. Este tipo de material de gel se ha utilizado anteriormente en protocolos de microscopía de dilatación, pero los geles resultantes se pueden expandir aproximadamente diez veces. El equipo del MIT optimizó el gel y el proceso de polimerización para fortalecer el gel y permitir una expansión 20 veces mayor.
Para estabilizar aún más el gel y aumentar su reproducibilidad, los investigadores eliminaron el oxígeno de la solución de polímero antes de la gelificación, lo que previene efectos secundarios que interfieren con la reticulación. Este paso requiere hacer pasar gas nitrógeno a través de la solución de polímero, que reemplaza la mayor parte del oxígeno en el sistema.
Una vez que se forma el gel, los enlaces de proteínas que mantienen unido el tejido se rompen y se agrega agua para expandir el gel. Una vez realizada la amplificación, se pueden etiquetar y obtener imágenes de las proteínas diana en el tejido.
“Este método puede requerir más preparación de muestras que otras técnicas de súper resolución, pero es mucho más simple en el proceso de obtención de imágenes real, especialmente en imágenes 3D”, dijo Shin. “Documentamos el protocolo paso a paso en el manuscrito para que los lectores puedan leerlo fácilmente”.
Microestructuras de imagen
Utilizando esta técnica, los investigadores pudieron obtener imágenes de muchas estructuras diminutas dentro de las células cerebrales, incluidas estructuras llamadas nanocolumnas sinápticas. Se trata de grupos de proteínas que se organizan de forma específica en las sinapsis neuronales, lo que permite que las neuronas se comuniquen entre sí mediante la liberación de neurotransmisores como la dopamina.
En estudios de células cancerosas, los investigadores también han obtenido imágenes de microtúbulos: tubos huecos que ayudan a dar estructura a las células y desempeñan un papel importante en la división celular. Pudieron ver la organización de las mitocondrias (orgánulos que generan energía) e incluso complejos de poros nucleares individuales (grupos de proteínas que controlan el acceso al núcleo celular).
Wang ahora está utilizando esta técnica para obtener imágenes de los carbohidratos conocidos como glicanos, que se encuentran en la superficie de las células y ayudan a regular las interacciones de las células con su entorno. El método también se puede utilizar para obtener imágenes de células tumorales, lo que permite a los científicos vislumbrar cómo se organizan las proteínas dentro de esas células, mucho más fácilmente de lo que era posible anteriormente.
Los investigadores prevén que cualquier laboratorio de biología debería poder utilizar esta técnica a bajo costo porque se basa en productos químicos estándar disponibles en el mercado y en equipos simples, como microscopios confocales y bolsas de guantes, que la mayoría de los laboratorios ya tienen o pueden acceder fácilmente.
“Nuestra esperanza es que con esta nueva tecnología, cualquier laboratorio de biología convencional pueda utilizar este protocolo con sus microscopios existentes, permitiéndoles alcanzar resoluciones que sólo pueden lograrse con microscopios de última generación muy especializados y costosos”, dijo Wang. .
La investigación fue financiada, en parte, por los Institutos Nacionales de Salud de EE. UU., una beca presidencial para graduados del MIT, una beca de investigación para graduados de la Fundación Nacional de Ciencias de EE. UU., Open Philanthropy, Good Ventures, el Instituto Médico Howard Hughes, Lisa Young y Ashar Aziz. Consejo Europeo de Investigación.