Un equipo de investigadores dirigido por Anna-Karin Gustavsson de la Universidad Rice ha desarrollado una innovadora plataforma de imágenes que promete avanzar en nuestra comprensión de las estructuras celulares a nanoescala. La plataforma, conocida como soTILT3D para láminas de luz inclinadas de un solo objetivo con funciones de dispersión de puntos (PSF) 3D, ofrece avances significativos en microscopía de superresolución, lo que permite obtener imágenes 3D rápidas y precisas de múltiples estructuras celulares, mientras que el entorno extracelular se puede controlar y flexibilizar. ajustado. . El estudio fue publicado recientemente comunicación de la naturaleza.
El estudio de las células a nanoescala proporciona información sobre los complejos procesos que impulsan el comportamiento celular, lo que permite a los investigadores descubrir detalles que son esenciales para comprender la salud y la enfermedad. Estos detalles pueden revelar cómo las interacciones moleculares contribuyen a la función celular, lo cual es importante para avanzar en terapias dirigidas y comprender la patogénesis de las enfermedades.
Aunque la microscopía de fluorescencia convencional ha sido útil para estudiar la estructura celular, se ha visto limitada por la dispersión de la luz, lo que limita su capacidad para resolver características de menos de unos pocos cientos de nanómetros. Además, si bien la microscopía de superresolución de una sola molécula ha proporcionado conocimientos innovadores sobre las estructuras biológicas a nanoescala, las técnicas existentes a menudo adolecen de una alta fluorescencia de fondo y velocidades de obtención de imágenes lentas, especialmente cuando se trata de muestras densas o agregados celulares complejos. Generalmente carecen de un control preciso y ajustable del entorno de la muestra.
La plataforma soTILT3D aborda directamente este desafío. Al combinar una lámina de luz en ángulo, un sistema de microfluidos nanoimpreso y herramientas computacionales avanzadas, soTILT3D mejora significativamente la precisión y la velocidad de las imágenes, permitiendo una visualización clara de cómo interactúan las diferentes estructuras celulares a nanoescala, incluso en muestras convencionalmente desafiantes.
la clave innovación
La plataforma soTILT3D utiliza una lámina de luz inclinada de un solo propósito para iluminar selectivamente rebanadas delgadas de una muestra, aumentando efectivamente el contraste al reducir la fluorescencia de fondo de las regiones desenfocadas, especialmente en muestras biológicas gruesas como las células de mamíferos.
“La lámina de luz se construye utilizando la misma lente objetivo que se usa en los microscopios para obtener imágenes, y es totalmente orientable, desviada para eliminar artefactos de sombra angular comunes en la microscopía de láminas de luz y permitiendo obtener imágenes hasta cubreobjetos”, dijo Gustavson, profesor asistente de química en Rice. e investigador asociado. “Esto nos permite obtener imágenes de muestras enteras de arriba a abajo con mayor precisión”.
La plataforma incorpora un sistema de microfluidos diseñado a medida con un microespejo metalizado personalizable incorporado, que permite un control preciso sobre el entorno extracelular y permite un rápido intercambio de soluciones, ideal para imágenes secuenciales de múltiples objetivos sin compensación de color ni reflejo de luz. Hojas en muestra.
“El diseño y la geometría del chip de microfluidos y el inserto nanoimpreso con microespejos se pueden adaptar fácilmente a diferentes muestras y escalas de longitud, lo que proporciona versatilidad en diferentes configuraciones experimentales”, dijo Nahima Saliba, coautora del artículo junto con su compañera estudiante de posgrado Gabriela Gagliano. , que es pequeño: el programa Rice A también está afiliado al Instituto Carle y al Programa de Posgrado en Física Aplicada.
Además, soTILT3D utiliza herramientas computacionales como el aprendizaje profundo para analizar concentraciones más altas de fluoróforos para mejorar la velocidad de obtención de imágenes y algoritmos para la corrección de la deriva en tiempo real, lo que permite obtener imágenes estables y de alta precisión durante largos períodos de tiempo.
“La ingeniería PSF de la plataforma permite obtener imágenes en 3D de moléculas individuales, mientras que el aprendizaje profundo maneja escenarios de irradiancia densa que son problemáticos con los algoritmos convencionales, lo que mejora significativamente la velocidad de adquisición”, dijo Saliba.
El dispositivo de microfluidos de SoTILT3D también admite imágenes de intercambio de pintura automatizadas, lo que permite la visualización secuencial de diferentes objetivos sin compensaciones de color comunes a los sistemas multicolores cuando se obtienen imágenes en profundidad a nanoescala.
innovador resultado
La plataforma soTILT3D ha demostrado mejoras significativas en la precisión y velocidad de las imágenes. La lámina de luz en ángulo de la plataforma mejora la relación señal-fondo para imágenes celulares hasta seis veces en comparación con los métodos tradicionales de epiiluminación, mejorando el contraste y permitiendo una localización precisa a nanoescala.
“Este nivel de detalle revela aspectos complejos de la arquitectura celular 3D que tradicionalmente son difíciles de observar con métodos convencionales”, dijo Gagliano.
En términos de velocidad, soTILT3D proporciona un aumento diez veces mayor cuando se combina con una alta densidad de emisión y un análisis de aprendizaje profundo, lo que permite a los investigadores capturar imágenes detalladas de estructuras complejas como la lámina nuclear, las mitocondrias y las proteínas de la membrana celular en toda la célula en una fracción de lo habitual. tiempo. . Además, la plataforma admite imágenes precisas de múltiples objetivos en 3D de células enteras, capturando la distribución de múltiples proteínas dentro de una célula entera y midiendo la distancia a nanoescala entre ellas. Los investigadores ahora pueden visualizar la disposición espacial de proteínas estrechamente espaciadas, como las proteínas de la lámina nuclear lamina B1 y lamina A/C y la proteína 2 asociada a la lámina con notable exactitud y precisión, proporcionando nuevos conocimientos sobre las organizaciones de proteínas y su papel en la regulación de la función celular.
extenso Aplicaciones en biología y medicina.
La plataforma soTILT3D abre nuevas posibilidades para investigadores en diversos campos. La capacidad de obtener imágenes de muestras complejas, incluidos agregados de células madre, extiende su aplicación más allá de las células individuales. La biocompatibilidad del sistema de microfluidos lo hace adecuado para la obtención de imágenes de células vivas, lo que permite a los científicos estudiar las respuestas celulares a diversos estímulos en tiempo real con un fotodaño reducido. Su función de intercambio de solución controlada con precisión hace de soTILT3D una herramienta ideal para examinar cómo los tratamientos farmacológicos afectan a las células en tiempo real.
“Nuestro objetivo con soTILT3D era crear una herramienta de obtención de imágenes flexible que supere las limitaciones de la microscopía de superresolución tradicional”, afirma Gustavsson. “Esperamos que estos avances impulsen los estudios en biología, biofísica y biomedicina, donde las interacciones complejas a nanoescala son clave para comprender la función celular en la salud y la patogénesis”.
Esta investigación fue financiada en parte por el apoyo financiero de las subvenciones R00GM134187 y R35GM155365 de los Institutos Nacionales de Salud al Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales, la subvención C-2064-20210327 de la Fundación Welch y fondos iniciales del Instituto de Investigación y Prevención del Cáncer de Tex. RR200025.